本发明属于生物工程领域,具体涉及一种重组硫酸软骨素酶AC及其制备方法与应用。本发明使用分子克隆技术通过提取硫酸软骨素酶AC基因设计引物,经PCR扩增后与表达载体连接,构建重组表达载体;将重组表达载体转化至大肠杆菌,构建重组表达转化体,实现重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的可溶性表达。构建过程操作简单,成本低。所构建的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白表达量高、具有较高的酶活性,粗酶活性可达到5082 U/L。且稳定性好,37℃条件下的半衰期为11 h,4℃下的半衰期有28天。对提升我国ChSase AC的生物表达的技术水平具有重要的科学意义。